Ä Riassunto
Le allergie alimentari sono provocate da risposte immunologiche anomale a determinate sostanze naturalmente presenti negli alimenti, generalmente di natura proteica.
Le manifestazioni che accompagnano una reazione allergica possono variare da lievi problemi a livello di cute o di apparato gastrointestinale a reazioni da shock anafilattico pericolose per la vita del soggetto.
Le allergie alimentari interessano approssimativamente l’1 – 2% della popolazione, sebbene il numero di manifestazioni che comportano rischi per la vita siano molto minori.
Virtualmente tutti gli allergeni alimentari sono proteine, ma solo una piccola frazione delle molte proteine presenti negli alimenti è allergenica.
Dal momento che la modificazione genetica comporta l’introduzione di nuove proteine nelle specie transgeniche, deve certamente essere valutata la sicurezza delle nuove proteine introdotte. La potenziale allergenicità delle nuove proteine introdotte dovrà sicuramente costituire il fulcro del processo di valutazione della sicurezza.
Una valutazione dell’allergenicità delle nuove proteine può essere fatta valutando la provenienza del gene, l’omologia di sequenza tra la nuova proteina e allergeni noti, la reattività immunochimica della nuova proteina con le IgE (anticorpi o immunoglobuline E) isolate dal siero di pazienti con nota allergia nei confronti della fonte da cui il materiale genetico è stato ottenuto e le proprietà fisiochimiche della nuova proteina.
Recentemente un approccio di questo tipo è stato adottato per valutare la possibile allergenicità di un tipo di soia transgenica che porta inserito un gene della noce del Brasile che codifica per una proteina ricca in metionina. Le noci del Brasile sono note per essere causa di allergie ed è stato dimostrato che la proteina ricca in metionina è il principale allergene. Di conseguenza, l’interesse da un punto di vista commerciale per questa varietà di soia è venuto meno.
Ä Introduzione
Il termine allergia alimentare è usato probabilmente in modo improprio sia da molti consumatori che anche da qualche medico per descrivere qualsiasi anomala ed indesiderata reazione ad un alimento (Anderson, 1996). Tuttavia è importante, per molte ragioni, distinguere tra i molti differenti tipi di manifestazioni che rientrano nella categoria individualistic adverse reactions to foods (Taylor, 1987). Come di seguito sottolineato, le vere allergie alimentari comportano risposte immunologiche abnormi nei confronti di alcune sostanze, generalmente proteine, normalmente presenti nei cibi (Mekori, 1996). Dal momento che le vere allergie comportano risposte anomale nei confronti di proteine, questo tipo di sensibilità alimentare deve essere tenuta in serio conto da parte dei biotecnologi che realizzano nuovi alimenti transgenici. Inoltre, nel caso delle reali allergie alimentari, il livello di tolleranza per quanto attiene l’esposizione alla proteina causa dell’allergia, è estremamente basso, sebbene vari da un individuo ad un altro (Taylor e Lehrer, 1996).

Le vere allergie alimentari devono essere distinte dalle intolleranze alimentari che comprendono quei tipi di sensibilità nei confronti di certi alimenti che non comportano un’anomala risposta da parte del sistema immunitario. Vi sono diverse forme di intolleranze alimentari, comprendenti reazioni anafilattoidi, disordini del metabolismo alimentare e reazioni idiosincratiche (Taylor, 1987). Le intolleranze alimentari non sono tipicamente causate da proteine di origine alimentare, ma sono invece provocate da una varietà di componenti a basso peso molecolare degli alimenti. Buoni esempi sono costituiti dall’intolleranza al lattosio (Lifshitz, 1998), un disordine alimentare legato alla deficienzea di b - galattosidasi nel piccolo intestino, e l’asma provocata dai solfati (Taylor et al., 1997), una patologia idiosincratica che coinvolge un meccanismo sconosciuto scatenato, nei soggetti sensibili, dall’ingestione di solfati comunemente usati come additivi alimentari. Nel casi di intolleranze alimentari, i soggetti sensibili possono tollerare l’assunzione di certe quantità dell’alimento "pericoloso". Poiché le intolleranze alimentari non sono tipicamente provocate da proteine, non saranno discusse ulteriormente nel presente articolo. Tuttavia è necessario sottolineare ancora il fatto che molti consumatori e talvolta anche alcuni medici non distinguono tra vere allergie alimentari ed intolleranze alimentari. Poiché alcuni tipi di intolleranza, come quella nei confronti del lattosio, sono piuttosto diffuse, non distinguere in modo corretto tra questi tipi di patologie può portare ad impressioni profondamente errate sulla presenza di numerosi casi di "allergie alimentari" nella popolazione.

Ä Vere allergie alimentari
Le vere allergie alimentari possono coinvolgere diversi tipi di risposte immunologiche anomale nei confronti delle proteine alimentari (Sampson e Burks, 1996). Le più comuni allergie alimentari sono mediate dalle IgE. Le reazioni mediate da IgE sono note come reazioni di ipersensibilità immediata poiché i sintomi si manifestano in un lasso di tempo che va da alcuni minuti a poche ore dopo l’ingestione dell’alimento nocivo. Le reazioni mediate da IgE possono essere provocate da polline, spore di muffe, forfora di animali, veleni di insetti ed altri stimoli ambientali, così come da alimenti. Probabilmente le allergie mediate da IgE affliggono il 10 - 25% della popolazione dei paesi sviluppati (Mekori, 1996), sebbene le allergie alimentari rappresentino una piccola frazione di tutte le allergie. Le altre fondamentali forme di allergie alimentari sono quelle caratterizzate da reazioni di ipersensibilità ritardata che coinvolgono linfociti sensibilizzati piuttosto che anticorpi (Sampson, 1990a). In queste reazioni di ipersensibilità ritardata i sintomi si manifestano più di otto ore dopo l’ingestione dell’alimento nocivo. Il ruolo degli alimenti in questo tipo di reazioni è tuttora incerto (Burks e Sampson, 1993). Tuttavia, il morbo celiaco, noto anche come enteropatia da sensibilità al glutine, è una ben nota forma di reazione di ipersensibilità ritardata che sarà discussa più avanti.

Allergie alimentari mediate da IgE
Secondo le stime più attendibili, le allergie alimentari mediate da IgE colpiscono, più o meno, l’1 – 2% della popolazione (Anderson, 1996; Taylor et al., 1989). I bambini in età infantile sono più comunemente colpiti rispetto agli adulti. La prevalenza fra i bambini sotto i tre anni può arrivare al 5 – 8% (Bock, 1987; Sampson, 1990b). Nonostante tutti gli esseri umani abbiano le IgE, solo alcuni individui hanno le IgE che riconoscono in modo specifico una certa proteina presente nell’ambiente, comprese quelle nei cibi. I figli di genitori allergici sono più predisposti, rispetto agli altri, a sviluppare allergie, comprese quelle alimentari (Mekori, 1996). I bambini in genere superano le allergie alimentari, specialmente quelle nei confronti del latte vaccino, delle uova e della soia (Bishop et al., 1990: Bock, 1982). Così, l’incidenza delle allergie alimentari tra gli adulti è significativamente più bassa che tra i bambini. I meccanismi coinvolti nell’acquisizione della tolleranza non sono stati pienamente compresi ma probabilmente coinvolgono una tolleranza a livello orale tramite l’attivazione di cellule T – suppressor, la maturazione di barriere intestinali e lo sviluppo di anticorpi IgA secretori nel lume dell’intestino (Burks e Sampson, 1993; Eigenmann e Sampson, 1994).

Otto alimenti o gruppi di alimenti sono responsabili del 90% o più delle gravi reazioni allergiche (FAO, 1995; Hefle et al., 1996). Questi alimenti sono: il latte vaccino, le uova, il pesce, i crostacei, le arachidi, la soia, la frutta secca (mandorle, noci, anacardi, ecc.) ed il grano. Reazioni allergiche nei confronti di frutta e verdura fresche (sindrome allergica orale) sono piuttosto comuni ma gli allergeni in questione sono piuttosto labili al calore (cottura e trattamenti vari) e sensibili agli acidi ed agli enzimi digestivi ed i sintomi sono piuttosto lievi e si limitano principalmente a prurito ed orticaria nella zona dell’orofaringe (Parker et al., 1990). Oltre agli otto alimenti sopra elencati, centosessanta altri alimenti o sostanze food – related sono state riconosciute come cause di reazioni allergiche in uno o più soggetti (Hefle et al., 1996). Questi includono molte granaglie, semi oleaginosi, vegetali e cibi lavorati come birra e cioccolato.
Il meccanismo prevede la formazione di IgE allergene – specifiche che mediano il rilascio di istamina e di altri mediatori della reazione allergica da parte di mast cellule sensibilizzate e di basofili. Durante il processo di sensibilizzazione, l’esposizione all’allergene stimola i linfociti B a produrre IgE specifiche per quell’allergene probabilmente con l’aiuto di linfociti T helper (Eigenmann e Sampson, 1994; Taylor et al., 1989). Le IgE si fissano a cellule specializzate, le mast cellule che sono presenti in molti tessuti, ed i basofili che sono nel sangue. In conseguenza dell’esposizione all’allergene, quest’ultimo provoca il legame crociato di due molecole di IgE sulla superficie della mast cellula o sulla membrana dei basofili che sono così stimolati a rilasciare un gran numero di mediatori della reazione allergica che comprendono l’istamina, i leucotrieni, le prostaglandine e molti altri (Winbery e Liebermann, 1995). Come risultato, l’esposizione ad una piccola quantità di allergene può provocare il rilascio di massicce quantità di mediatori allergici. Così, il livello di tolleranza nei confronti degli allergeni in molti casi è piuttosto basso. Nel caso delle allergie alimentari, il livello di tolleranza non è ben conosciuto ed è probabile che sia variabile da un soggetto ad un altro (Taylor e Lehrer, 1996). Tuttavia, l’assunzione di quantità dell’ordine di qualche milligrammo del cibo che causa l’allergia può essere sufficiente a provocare i sintomi propri dell’allergia (Taylor e Lehrer, 1996).

I mediatori rilasciati dalle mast cellule e dai basofili possono provocare svariati sintomi a carico di diversi organi. La tabella 1 fornisce una lista delle manifestazioni più comuni delle allergie alimentari (Lemke e Taylor, 1994). I soggetti allergici, comunque, non manifestano tutti questi sintomi. Tra i vari individui, la natura dei sintomi nelle allergie alimentari è piuttosto variabile. Le manifestazioni più gravi sono l’asma, l’edema della laringe e lo shock anafilattico. Tutte queste manifestazioni rappresentano un serio pericolo per la vita del soggetto. Si sono accertati casi di morte conseguenti all’ingestione casuale, da parte di soggetti allergici, di alimenti contenenti l’allergene (Sampsone et al., 1992; Yunginger et al., 1988). In proporzione sono pochi gli individui con allergie alimentari che vanno incontro a reazioni pericolose per la loro vita conseguenti all’esposizione all’allergene. Sintomi più blandi, come la già citata sindrome allergica orale, sono manifestazioni più comuni.

Le allergie madiate dalle IgE sono associate ad alcune proteine o allergeni presenti nei cibi. Bush e Hefle (1996) hanno descritto gli allergeni conosciuti presenti in molti alimenti allergenici, comuni e non. Virtualmente tutti gli allergeni di origine alimentare sono proteine. Tuttavia, solo una piccola percentuale delle molte migliaia di proteine alimentari sono allergeni. Gli allergeni alimentari sono proteine capaci di elicitare la formazione di IgE allergene – specifiche e di molecole di IgE che formano cross – link sulla superficie delle mast cellule sulle membrane dei basofili stimolando il rilascio di istamina e di altri mediatori della reazione allergica. Molti alimenti allergenici contengono allergeni multipli. Gli alimenti possono contenere allergeni sia principali che di minore importanza (Bush e Hefle, 1996). Gli allergeni principali sono generalmente definiti come proteine nei confronti delle quali il 50% o più dei soggetti allergici presenta IgE specifiche (King et al., 1994). Un sistema di nomenclatura è stato realizzato per allergeni sia di origine alimentare che non (King et al., 1994). Questo sistema di nomenclatura usa le prime tre lettere del gene seguite dalla prima lettera della specie e per ultimo un numero arabo. Il numero viene assegnato all’allergene in base all’ordine della sua identificazione. Ad esempio, le arachidi contengono diversi allergeni noti che comprendono Ara h 1 e Ara h 2 (Burks et al., 1991; Burks et al., 1992). Le sequenze aminoacidiche di molti allergeni alimentari sono conosciute (Metcalfe et al., 1996). Le sequenze aminoacidiche degli epitopi (regioni che legano le IgE) di queste proteine, sono note solo in alcuni casi (Bush e Hefle, 1996). Molti allergeni alimentari, specialmente quelli presenti nei comuni alimenti allergenici, sono presenti in una misura compresa generalmente tra l’1.0 e l’80% delle proteine totali.

Gli allergeni alimentari tendono ad essere stabili durante i processi digestivi ed i vari trattamenti per la loro preparazione (Taylor e Lehrer, 1996). La capacità degli allergeni alimentari di raggiungere e di attraversare la barriera costituita dalla mucosa intestinale in una forma immunologicamente intatta è probabilmente un prerequisito per l’allergenicità (Metcalfe et al., 1996). Astwood et al. (1996) in un modello di digestione gastrointestinale simulata hanno dimostrato che gli allergeni alimentari erano piuttosto stabili durante la digestione. Gli allergeni alimentari tendono inoltre a resistere alla denaturazione termica (Taylor e Lehrer, 1996). Questa proprietà consente loro di sopportare i trattamenti termici e la cottura.

Le allergie alimentari mediate da IgE sono generalmente trattate con diete specifiche che escludono il/i cibi/i pericoloso/i (Taylor et al., 1986). Dal momento che il livello di tolleranza per il cibo in questione è molto basso, deve essere fatta molta attenzione nella compilazione di diete sicure che garantiscano l’assenza delle sostanze pericolose.

Il morbo celiaco è una risposta immunologia abnorme alle frazioni proteiche di glutine di grano, orzo, segale e avena, mediata dai linfociti nel piccolo intestino (Ferguson, 1996). La reazione infiammatoria distrugge la funzione assorbente della mucosa del piccolo intestino. Come risultato, il morbo celiaco comporta una sindrome da malassorbimento caratterizzata da perdita di peso, anemia, diarrea e dolori ossei, oltre ad altri sintomi. Proteine specifiche nella frazione gliadinica di grano sono state associate al morbo celiaco. Anche questa malattia viene curata con diete da cui sono esclusi i cibi che contengono gli antigeni responsabili della reazione.

Ä Valutazione dell’allergenicità
Nel 1996, l’International Food biotechnology Council in collaborazione con l’Allergy and immunology Institute of International Life Science Institute hanno messo a punto un decision – tree approach per la valutazione dell’allergenicità di alimenti geneticamente modificati (Metcalfe et al., 1996). Questa strategia è basata sull’origine del gene, l’omologia di sequenza tra la nuova proteina e allergeni noti, la reattività immunochimica della nuova proteina con le IgE isolate dal siero di pazienti con nota allergia nei confronti della fonte da cui il materiale genetico è stato ottenuto e le proprietà fisiochimiche della nuova proteina (Metcalfe et al., 1996; Taylor, 1997).

Le fonti del materiale genetico possono essere classificate come allergeni comuni (gli otto alimenti o gruppi di alimenti già citati), allergeni meno comuni (i centosessanta alimenti identificati da Hefle et al., 1996), o allergeni sconosciuti. L’approccio alla valutazione di allergenicità varia a seconda della natura della fonte del materiale genetico trasferito.

Se il materiale genetico proviene da una fonte più o meno comune di cui sia nota l’allergenicità, e la proteina codificata è espressa nella parte commestibile dell’organismo geneticamente modificato, è allora necessario produrre dati che determinino se il gene codifica per un allergene. In tali situazioni, il primo passaggio del processo, è la valutazione dell’immunoreattività della nuova proteina introdotta con le IgE presenti nei sieri di soggetti allergici nei confronti dell’organismo donatore del materiale genetico. Il siero può essere testato per la reattività sia con la nuova proteina, sia con estratti del cibo transgenico mediante immunosaggi (Taylor e Lehrer, 1996; Yunginger e Adolphson, 1992). Se il materiale genetico è ricavato da una comune fonte di allergeni, dovrebbero essere usati quattordici sieri per il test (Metcalfe et al., 1996). Con 14 sieri, un risultato negativo nell’immunosaggio fornisce una garanzia superiore al 99,9% che un allergene principale dell’organismo donatore non è stato trasferito ed una garanzia superiore al 95% che un allergene minore (che interessa almeno il 20% della popolazione sensibile) non è stato trasferito. Se il materiale genetico proviene da una fonte meno comune di allergeni, dovrebbero essere usati cinque sieri per il test tenendo presente che sarà più difficile identificare individui con queste allergie (Metcalfe et al., 1996). Con cinque sieri, un risultato negativo nell’immunosaggio fornisce una garanzia superiore al 95% che un allergene principale dell’organismo donatore non è stato trasferito. Sebbene questo grado di affidabilità sia inferiore rispetto a quello dato da proteine derivanti da fonti comuni di allergeni, sia la quota di popolazione interessata, sia il conseguente rischio per i consumatori, sono più bassi. Un risultato positivo negli immunosaggi in vitro costituirebbe una prova sufficiente dell’allergenicità dell’alimento transgenico.

In caso di risultati negativi o equivoci negli immunosaggi in vitro con alimenti transgenici che contengono materiale genetico proveniente da alimenti allergenici comuni, l’alimento transgenico dovrebbe essere testato ulteriormente con skin – prick test in vivo su un appropriato numero di soggetti allergici (Bock et al., 1997; Taylor e Lehrer, 1996). Un risultato positivo nei skin – prick test indica che l’estratto del cibo transgenico è in grado di stimolare il rilascio di istamina dalle mast cellule della pelle in vivo. In fine, il decision – tree approach suggerisce che la sicurezza del prodotto transgenico sia confermata usando il metodo del doppio cieco (duble – blind placebo controlled food challenger =- DBPCFC) con pazienti allergici (Bock et al., 1988; Taylor e Lehrer, 1996). Un risultato positivo in uno o l’altro di questi test in vivo sarebbe una prova sufficiente dell’allergenicità del prodotto transgenico.

Mentre un approccio simile potrebbe essere logico nel caso di alimenti transgenici che contengono materiale genetico proveniente da fonti di allergeni poco comuni, non è ragionevole attendersi che un sufficiente numero di soggetti con l’allergia in questione possa essere radunato dove si renda necessario per i test in vivo. Tuttavia il rischio è molto basso nei casi in cui i risultati negativi sono ottenuti negli immunosaggi che impiegano 5 o più sieri per il test. Se vengono usati meno di 5 sieri, il decision – tree approach prevede una valutazione della stabilità della/e proteina/e di nuovo inserimento alla digestione ed ai trattamenti.

La valutazione più difficile riguarda il materiale genetico ottenuto da fonti di cui sia sconosciuto il potenziale allergenico come virus, batteri, insetti e piante non – food. La probabilità che le proteine derivate da tali fonti di DNA siano allergeniche non è molto alta, poiché molte proteine presenti in natura non lo sono (Taylor, 1997). Inoltre, molte di queste proteine saranno espresse nei cibi transgenici a livelli molto bassi, mentre la sensibilizzazione allergica è più frequentemente associata alle major proteins presenti negli alimenti (Taylor, 1997).

Il primo passo nella valutazione di questi alimenti transgenici è il confronto tra la sequenza aminoacidica della proteina introdotta e le sequenze aminoacidiche di allergeni noti. Le sequenze aminoacidiche di 198 allergeni principali, compresi quelli alimentari, sono note (Metcalfe et al., 1996). In questa decision – tree strategy una significativa similarità della sequenza richiederebbe un match di almeno otto aminoacidi contigui identici (Metcalfe et al., 1996). In generale, la lunghezza minima del peptide per il legame alle cellule T, che sarebbe richiesta per la sensibilizzazione allergica, sembra essere di otto o nove aminoacidi (Pernis, 1992; Rothbart e Gefter, 1991). La lunghezza del peptide richiesta per un epitopo che leghi le IgE sarebbe ancora superiore (Rothbart e Gefter, 1991). Così, un match basato sull’identità di otto aminoacidi contigui identici sembra essere un approccio prudente. Dal momento che questo approccio considera tutta la sequenza della proteina, non è basato solamente sull’identità della sequenza aminoacidica con quella degli gli epitopi conosciuti degli allergeni noti (Taylor, 1997). Poiché non sono disponibili sufficienti informazioni sulla sequenza aminoacidica degli epitopi degli allergeni, specialmente quelli alimentari, l’approccio più appropriato prevede la ricerca di zone di confronto per l’intera lunghezza del polipeptide (Taylor, 1997). Naturalmente, con tale approccio si possono rilevare match privi di significato che non hanno nulla a che vedere con il legame con le IgE. Inoltre, questo approccio è chiaramente limitato dal fatto che non consente di identificare gli epitopi discontinui o conformazionali che dipendono dalla struttura terziaria della proteina (Metcalfe et al., 1996). Tuttavia, la stabilità al calore degli allergeni alimentari depone a favore di una maggiore importanza degli epitopi lineari e continui di questi particolari allergeni.

Se viene rilevata un’omologia di sequenza tra un allergene noto e la proteina introdotta, allora questa proteina dovrebbe essere valutata per l’immunoreattività usando sieri di soggetti sensibili nei confronti di quel particolare allergene. L’approccio diviene simile a quello usato quando il materiale genetico proviene da una fonte di allergeni nota.

Se non viene riscontrata alcuna omologia di sequenza con allergeni noti, viene allora valutata la stabilità della proteina alla digestione ed ai vari trattamenti. Modelli che simulano i processi digestivi gastrointestinali nei mammiferi sono stati adottati per valutare la stabilità digestiva di allergeni alimentari noti e di proteine introdotte nei cibi attraverso le modificazioni genetiche (Astwood et al., 1996). La stabilità durante i processi di lavorazione deve essere affrontata caso per caso in base alla conoscenza del trattamento a cui potrebbe essere sottoposto l’alimento.

Questo decision – tree aprroach è già stato usato per la valutazione dell’allergenicità di prodotti alimentari transgenici. Un tipo di soia transgenica che contenga una proteina di riserva ad alto contenuto in metionina derivata dalla noce del Brasile, è stata introdotta per migliorare i mangimi. Dal momento che la noce del Brasile è un alimento che comunemente causa allergie, è stata effettuata una valutazione di allergenicità. Immunosaggi con siero di pazienti con conosciuta allergia alla noce del Brasile hanno rivelato che la proteina di riserva trasferita dalla noce del Brasile era probabilmente un allergene (Nordlee et al., 1996). Con elettroforesi su gel di poliacrilamide - SDS ed immunoblotting con sieri di soggetti allergici, è stato dimostrato che la proteina con elevato contenuto di metionina era effettivamente l’allergene principale della noce del Brasile (precedentemente non identificato, ora identificato come Ber e 1) poiché è stato identificato dal siero di otto dei nove pazienti (Nordlee et al., 1996). Questa proteina è stata identificata anche nella soia transgenica. Il potenziale allergenico della soia transgenica è stato ulteriormente confermato da skin – pick test positivi in soggetti allergici alla noce del Brasile (Nordlee et al., 1996). In conseguenza, questa varietà di soia transgenica ha perso ogni interesse da un punto di vista commerciale.

Anche Monsanto ha usato questo decison – tree approach per valutare la potenziale allergenicità della sua soia tollerante il glifosato (Harrison et al., 1996). L’enzima trasferito in questa soia transgenica non ha una significativa omologia di sequenza con allergeni noti. Questo enzima è inoltre rapidamente digerito in sistemi che simulano i processi digestivi dei mammiferi (Harrison et al., 1996).

Ä Conclusioni
Esiste una logica decision – tree strategy per valutare la potenziale allergenicità di organismi geneticamente modificati. Fino ad ora, questo approccio è stato testato solo su di un ristretto numero di alimenti transgenici. Tuttavia, questa strategia ha avuto successo nell’impedire l’immissione sul mercato di un tipo di soia transgenica che conteneva il principale allergene della noce del Brasile.

Tabella 1: Comuni manifestazioni delle allergie alimentari mediate da IgE

Sintomi gastrointestinali Nausea Vomito Diarrea Dolori addominali	Manifestazioni cutanee Orticaria Eczema o dermatiti Angioedema Prurito
Sintomi respiratori Riniti Asma	Altri sintomi Edema della laringe Shock anafilattico Ipotensione Sindrome allergica orale

* Department of Food Science and Technology
University of Nebraska, USA

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