B1. NORME TECNICHE PER PROCESSI SU LARGA SCALA E DI PRODUZIONE: CARATTERISTICHE ED OBIETTIVI.

Tra i quattro Gruppi di Lavoro - i.e. laboratori di R&S, impianti industriali, agricoltura, apparecchiature - in cui è stato ripartito il carico di attività identificato dal mandato della Commissione Europea al CEN, il secondo è quello che più rapidamente ha terminato il proprio lavoro: sette norme tecniche sono state pubblicate in inglese, francese e tedesco (lingue ufficiali del CEN), concernenti i processi biotecnologici su larga scala e di produzione. La circostanza ha costituito occasione per impostare i criteri metodologici anche degli altri Gruppi di Lavoro, evidenziando l'utilità di adottare norme tecniche nell'esecuzione di attività produttive e la necessità di associare l'efficienza delle prestazioni alla sicurezza del personale e dell'ambiente.
Centrale, in questo contesto, è la corretta misura da dare - in una situazione di ipotetico "pericolo" - alla quantificazione del "danno" ed alla valutazione del "rischio" potenziale (i.e. probabilità che il danno si materializzi nelle reali condizioni operative). Nel caso specifico di impiego di agenti biologici - geneticamente modificati o meno - la quantificazione del danno biologico è prevalentemente basata sull'esperienza e, in caso di insufficienti dati sperimentali, essa è dominata dal principio di precauzione: il momento della prevenzione del danno a livello di progettazione deve essere privilegiato rispetto al momento della gestione dei rischi a livello operativo.
Da questo approccio derivano la natura e la sequenza delle sette norme tecniche elaborate per i processi biotecnologici su larga scala e di produzione, a partire dalla progettazione dell'impianto sino al controllo e gestione delle materie prime, dei processi e dei rifiuti, per finire ai criteri di controllo della qualità.
Nella tabella che segue sono elencati i titoli delle norme tecniche e la loro sigla EN di classificazione formale.

EN 1619	Requisiti generali per la gestione e l'organizzazione delle procedure di conservazione delle linee cellulari
EN 1620	Installazione dell'impianto secondo il livello di pericolo
EN 1826	Procedure di controllo per le materie prime
EN 12075	Procedure per i processi di fermentazione e i trattamenti a valle
EN 12307	Linee guida per buona prassi, procedure operative, formazione e controllo del personale
EN 12460	Guida alla selezione ed all'installazione dell'attrezzatura in funzione del rischio biologico
EN 12461	Guida al trattamento, inattivazione e controllo dei rifiuti

Ogni norma tecnica è strutturata secondo un "formato" standard, che prevede sezioni iniziali come Introduzione, Scopo e Campo di Applicazione, Riferimeuti Normativi e Definizioni, e sezioni finali sotto forma di una o più Appendici di natura informativa, delle quali una è sempre riservata ai riferimenti bibliografici.
Il cuore delle norma tecniche è costituito da più sezioni descrittive, che illustrano i requisiti da rispettare per il disegno degli impianti, per la selezione dei componenti, per le procedure operative e per il comportamento del personale.
Il rispetto delle norme tecniche nella loro globalità garantisce all'utente la "presunzione di conformità" con i dettami di Direttive e Regolamenti dell'Unione Europea a cui esse si riferiscono: nello specifico caso degli impianti biotecnologici di tipo industriale, le norme tecniche sono principalmente orientate alla sicurezza dell'ambiente e del personale addetto.

B.2. SCHEDE SINOTTICHE

Requisiti generali per la gestione e l'organizzazione delle procedure di conservazione delle linee cellulari.
Questa norma tecnica specifica i requisiti necessari per gestire ed organizzare le procedure di conservazione di linee cellulari dei microrganismi usati nei processi biotecnologici su larga scala a fini produttivi. Essa ha l'obiettivo di garantire sia la sicurezza della manipolazione sia la riproducibilità dei prodotti risultanti dai processi biotecnologici.
Sono specificati i metodi di manipolazione e conservazione dei ceppi di microrganismi o di linee cellulari derivate da animali, piante o virus, in modo da ottenere colture cellulari riproducibili e sicure per la produzione industriale. La gestione delle linee cellulari si concretizza nella creazione di Banche Cellulari - Banca primaria e Banca Secondaria - secondo la prassi normalmente seguita nell'industria farmaceutica.
La norma tecnica copre una vasta gamma di applicazioni, dai microrganismi naturali -inclusi quelli migliorati con tecniche tradizionali - sino ai microrganismi geneticamente modificati (GMM, nell'acronimo inglese), siano essi patogeni o non patogeni.
Significativa è la sezione delle Definizioni, mentre accurata ed aggiornata è l’Appendice A, che riporta la classificazione dei microrganismi patogeni per l'uomo, per le piante e per gli animali.

Installazione dell'impianto secondo il livello di pericolo.
Questa norma tecnica ha lo scopo di assicurare la sicurezza delle operazioni industriali e specifica i requisiti di progetto per gli impianti qualora la manipolazione dei microrganismi di processo e/o i loro prodotti presentino un qualche grado di rischio biologico.
La norma tecnica copre una vasta area di applicazioni industriali delle biotecnologie, siano esse riferibili alle pratiche tradizionali di microbiologia così come a quelle riferibili alle moderne tecnologie biologiche, oggetto di specifiche Direttive dell'Unione Europea. Pertanto sono prese in considerazione operazioni con microrganismi naturali, con microrganismi "migliorati" mediante tecniche tradizionali e con microrganismi geneticamente modificati, siano essi patogeni o non patogeni.
Le caratteristiche dell'impianto previsto per un "processo" biotecnologico dipendono strettamente dalle valutazioni preventive del rischio, in base ai quali vengono stabiliti i livelli di contenimento fisico (1) da utilizzare per le singole operazioni. Viene fornito - ed illustrato separatamente - un esempio specifico di impianto biotecnologico, costituito da fermentatori e da apparecchiature per trattamenti a valle.
La norma tecnica dedica attenzione ai fabbricati, che devono essere progettati in modo da prevenire rischi potenziali e devono tenere in considerazione:
- il grado di pericolo biologico;
- la via di esposizione al danno biologico;
- le modalità di manipolazione (e.g. sistema aperto o chiuso, fase aperta o chiusa).
I requisiti progettuali dei fabbricati, che costituiscono la parte centrale della norma tecnica, sono articolati a seconda del livello di contenimento fisico previsto per l'impianto.
- Livello di contenimento 1: non esistano particolari requisiti progettuali oltre ai requisiti generali.
- Livello di contenimento 2: il fabbricato deve essere progettato in modo da minimizzare la dispersione di microrganismi.
- Livello di contenimento 3: il fabbricato deve essere progettato in modo da prevenire la dispersione di microrganismi.
- Livello di contenimento 4: sono necessari requisiti speciali, determinati caso per caso dalle autorità nazionali.
I requisiti minimi per prevenire la dispersione di microrganismi sono indicati in una apposita tabella, che illustra la situazione dei quattro diversi livelli di contenimento.
Parte essenziale della norma tecnica è la classificazione dei microrganismi in base a specifici criteri riportati nella Appeudice A.
- Patogenicità per l'uomo: categorie da 1 a 4 in funzione di rischio crescente per quanto riguarda l'induzione di malattie, la loro propagazione e le possibilità o meno di profilassi e/o terapia (cf. allegato alla Direttiva 90/679/CEE ed al Decreto Legislativo 926/93 di pari argomento).
- Patogenicità per le piante: categorie di rischio crescente da 1 a 3 (i.e. Ep1, Ep2, Ep3) in funzione di criteri di salvaguardia delle piante da batteri, funghi, virus,…..
- Patogenicità per gli animali: categorie di rischio crescente da 1 a 3 (i.e. Eal, Ea2, Ea3) in funzione di analoghi criteri di salvaguardia della salute animale.

(1) Sistema atto a confinare un microrganismo/organismo o un'altra entità all'interno di uno spazio definito, onde limitare/impedire la fuga nell'ambiente di lavoro.

Procedure di controllo per le materie prime
Questa norma tecnica illustra le procedure di controllo delle materie prime da utilizzare in processi biotecnologici. Un'appropriata selezione delle materie prime e' infatti essenziale ai fini della qualità e della sicurezza dei processi e dei prodotti finali, in quanto permette di prevenire potenziali pericoli - in particolare derivanti da agenti contaminanti di natura microbica - che possono avere effetti dannosi nei vari momenti dei processi di lavorazione ed in particolare:
- nell'immagazzinamento;
- nel corso delle varie operazioni produttive;
- nel prodotto finale.
I parametri che determinano una corretta selezione ed un corretto utilizzo delle materie prime orientano le procedure di controllo. Tuttavia, date le differenti proprietà intrinseche delle varie materie prime utilizzabili - la norma tecnica non si occupa di apparecchiature - non è possibile una generalizzazione delle procedure di controllo, bensì soltanto una standardizzazione dei criteri da adottare.
Ogniqualvolta si introduce o si modifica una materia prima, deve essere adottata una lista di specifiche e di saggi di verifica atti a garantire la qualità del prodotto finale e a limitare al minimo i rischi per la salute, la sicurezza e l'ambiente. La parte descrittiva della norma tecnica include inizialmente una sezione generalità, in cui sono enunciati i criteri essenziali per sviluppare e certificare le procedure di controllo, inclusa la lista delle specifiche "ritagliate" in funzione della natura delle materie prime e delle caratteristiche del processo industriale. In questa sezione vengono elencate, a titolo di esempio, un certo numero di materie prime che dovrebbero normalmente essere prese in considerazione nei processi biotecnologici.
Successivamente, la norma tecnica illustra la sequenza delle procedure di controllo e le evidenzia per maggiore chiarezza in uno schema a blocchi.
La sequenza può essere sintetizzata con segue:
- valutazione della compatibilità delle materie prime con il processo produttivo, tenendo in debito conto tutti i rilevanti fattori di sicurezza;
- verifica al ricevimento, nel corso della quale la gamma dei controlli si estende dalla verifica dell'integrità delle confezioni e della corrispondenza tra ordine, bolle consegna, etichette,….., sino a tutti i saggi di verifica atti a controllare la conformità dei prodotti alle specifiche d'ordine concordate;
- verifica dopo il periodo di "quarantena", mediante la quale il rispetto delle specifiche è verificato con metodi di prova adeguati (per esempio utilizzando procedure convalidate);
- messa a punto e controllo delle procedure di immagazzinamento etichettatura, mediante le quali le materie prime in arrivo dal fornitore e/o dalla quarantena sono conservate nelle condizioni appropriate stabilite dall'utilizzatore.

Procedure per i processi di fermentazione e i trattamenti a valle
Questa norma tecnica illustra i criteri generali di valutazione e di selezione dei processi operativi per fermentazione e trattamenti successivi, tali da garantire la sicurezza del personale e dell'ambiente, unitamente alla sicurezza e qualità dei prodotti. Essa entra nei dettagli di singoli processi di produzione, che possono anche richiedere specifiche apparecchiature e unità operative. La parte normativa dello standard tratta inizialmente della sequenza di operazioni necessarie per realizzare il processo di fermentazione e successivamente i trattamenti a valle richiesti per la separazione del prodotto purificato dai residui di processo e dai rifiuti.
L'operazione di fermentazione è definita come il processo biotecnologico ove uno specifico prodotto è preparato a partire da materie prime mediante culture di appositi "microrganismi di processo" realizzate e "cresciute" in appositi contenitori, sia aperti che chiusi, mantenuti in condizioni rigidamente controllate. I trattamenti "a valle" possono includere molteplici processi chimici, fisici e chimico - fisici come filtrazione, cristallizzazione, scambio ionico, cromatografia, elettrodialisi, estrazione, ecc.
Successivamente la norma tecnica rinvia alle procedure ed ai regolamenti europei già esistenti per quanto riguarda imballaggio, etichettature, stoccaggio, trasporto dei prodotti e dei residui.
Particolare attenzione viene dedicata al capitolo della gestione dei rischi (risk management), i cui criteri hanno un diretto impatto sulle procedure di controllo. Il capitolo si articola in:
- valutazione dei rischi per personale, ambiente e prodotti, in funzione del tipo di microrganismi impiegati e del loro grado di pericolo, in base alla classificazione delle specifiche Direttive dell'Unione Europea;
- descrizione dei rischi potenziali derivati dal tipo di processo e impianto utilizzato (e.g. rilascio di aerosol, contaminazioni, difetti dei sistemi di contenimento, non omogeneità delle materie prime);
- controllo dei rischi, da effettuare periodicamente durante le fasi di progettazione e di produzione. implicante una revisione continua dell'efficienza ed efficacia delle procedure di verifica e della relativa documentazione (e.g. adeguata preparazione, pulizia e sterilizzazione dell'apparecchiatura in fasi successive di lavorazione).

Linee guida per buona prassi, procedure operative, formazione e controllo del personale
Questa norma tecnica illustra le linee guida per adottare buone prassi operative, volte ad assicurare corrette procedure di lavoro ed a garantire l'addestramento ed il controllo del personale addetto a processi biotecnologici su larga scala, soprattutto a fini produttivi. La norma prende in considerazione non solo operazioni con microrganismi geneticamente modificati (GMM) ma anche operazioni con microrganismi naturali, patogeni e non patogeni.
Questa norma tecnica è particolarmente focalizzata sulla protezione dai rischi biologici dei lavoratori addetti ad impianti biotecnologici e sulle precauzioni operative da adottare per evitare danni all'ambiente, inclusi animali e piante. Per la protezione del personale, la norma tecnica fa riferimento ai livelli di "contenimento fisico" riportati nella norma tecnica "Installazione dell'impianto secondo il livello di pericolo", descritta più sopra, e ad altre preesistenti norme tecniche del CEN in materia di indumenti ed attrezzature protettive (guanti, occhiali, maschere, ecc.).
La parte prescrittiva della norma tecnica affronta gli aspetti generali di "manipolazione" di agenti biologici, sulla base dell'esperienza acquisita e delle buone prassi dei laboratori di microbiologia. Viene chiarito che le cosiddette "norme di buona prassi di fabbricazione", valide per l'industria farmaceutica, vanno interpretate in questa norma tecnica come "norme di buona prassi microbiologica". Proprio in base a questo concetto, la norma tecnica fornisce una serie di "raccomandazioni" per la manipolazione di microrganismi in attività di produzione e su larga scala.
A queste raccomandazioni di base si aggiungono nelle sezioni successive delle norme addizionali per la manipolazione di microrganismi a rischio crescente, trattati quindi in locali di livello di contenimento 2, 3 e 4: tali norme addizionali sono ovviamente basate su criteri di severità crescente.
Una specifica sezione dedica particolare attenzione alla formazione del personale, per il quale sono previsti regolari corsi di addestramento, di natura e frequenza dipendente dal tipo di operazioni da eseguire e dai pericoli ad esse connessi. La relativa documentazione - protocolli e manuali di istruzione - e' soggetta ad ispezioni interne e a revisioni periodiche di verifica ed aggiornamento e costituisce la base per le procedure di controllo del personale, sia per quanto riguarda la loro sicurezza sia per quanto concerne il loro grado di addestramento.

Guida alla selezione ed all'installazione dell'attrezzatura in funzione del rischio biologico
Questa norma tecnica fornisce le linee guida per la selezione dell'attrezzatura da impiegare in un processo biotecnologico in base a precisi criteri di valutazione dei rischi derivanti da:
- natura del microrganismo e suo pericolo biologico;
- probabilità di fuoriuscita del microrganismo dall'attrezzatura;
- possibilità/probabilità di esposizione al microrganismo dell'operatore e/o dell'ambiente.
L'obiettivo della norma tecnica e' la realizzazione - attraverso un'oculata scelta dell'attrezzatura - di adeguati livelli di contenimento, tali da garantire la sicurezza degli operatori e dell'ambiente durante lo svolgimento dei processi biotecnologici.
Essa illustra una sequenza di considerazioni/raccomandazioni atte a favorire la selezione dell'attrezzatura.
- Esame di rischio biologico dei microrganismi da utilizzare, in base alla loro classificazione di riferimento, riportata nelle Direttive dell'Unione Europea.
- Esame delle operazioni da realizzare, comprese le differenti fasi del processo (e.g. separazione, filtrazione, concentrazione).
- Esame delle attrezzature da impiegare nelle varie fasi del processo (e.g. centrifughe, filtri, concentratori).
- Analisi iniziale dei rischi, combinando la pericolosità intrinseca dei microrganismi con la probabilità di loro fuoriuscita dall'attrezzatura (per natura stessa dell'operazione o per difetto di tenuta dell'attrezzatura) e conseguente possibilità di esposizione del personale. Il rischio globale risultante viene riportato in apposita tabella come "trascurabile", "basso", "medio" o "alto".
- Progettazione dettagliata dell'impianto, tenendo contro dell'installazione delle attrezzature scelte per le singole fasi del processo e dei livelli di contenimento richiesti.
- Analisi dettagliata dei rischi dell'impianto risultante dall'installazione delle varie attrezzature e dalla pianificazione sequenziale delle operazioni di processo; sono esaminate le conseguenze di eventuali correzioni di piano.
- Verifica delle prestazioni pratiche sia delle singole attrezzature sia del sistema globale, tenendo conto anche delle esigenze di manutenzione e della corrente pratica operativa.
- Messa a punto e adozione di procedure di controllo periodiche e della relativa documentazione, richiesta delle norme di buona prassi.
La norma tecnica è corredata da un'Appendice informativa, che esemplifica in dettaglio la procedura completa di analisi e gestione dei rischi collegabili alle attrezzature nelle varie fasi del processo operativo.

Guida al trattamento, inattivazione e controllo dei rifiuti
Questa norma tecnica fornisce linee guida per la valutazione e selezione di procedimenti di trattamento dei rifiuti provenienti da impianti biotecnologici, in particolare di quelli contenenti microrganismi residui a fine processo.
La norma tecnica prende in considerazione tutti i processi biotecnologici, dalle tradizionali fermentazioni per prodotti alimentari, farmaceutici e chimici sino ai più recenti processi biotecnologici di interesse agricolo e ambientale.
I processi di trattamento, tali da garantire la sicurezza di operatori ed ambiente, devono essere in grado di permettere il trasferimento di rifiuti biotecnologici, sia solidi che liquidi o gassosi ai normali circuiti di trattamento di rifiuti urbani ed industriali. La norma tecnica non prende in considerazione i rifiuti ospedalieri né il trattamento di rifiuti pericolosi dal punto di vista chimico o fisico.
Da queste considerazioni, che chiariscono gli scopi della norma, deriva la sequenza dei vari capitoli della parte normativa, corredata da numerose tabelle ed appendici illustrative. In particolare.
- Definizione della politica di trattamento dei rifiuti che si intende adottare (ad esempio riduzione dei volumi, recupero dei materiali, ecc.).
- Caratterizzazione dei flussi di produzione dei rifiuti provenienti sia dal processo di fermentazione vero e proprio sia dai processi successivi.
-Definizione delle procedure da seguire, a partire dall'identificazione dei problemi (e.g. natura dei microrganismi, tipo di residui) sino alla scelta sistema di trattamento ed alla sua convalida.

- Descrizione delle metodologie di trattamento in funzione della natura dei rifiuti e dell'efficienza di inattivazione richiesta.
- Trattamento termico a temperature variabili da 60°~70°C sino a l2l°~14°°C.
- Trattamento chimico con disinfettanti diversi (e.g. acidi, basi, alcoli).
- Radiazioni (solitamente radiazione ultraviolette).
- Incenerimento di rifiuti solidi e liquidi.
- Filtrazione su affluenti gassosi e liquidi.
- Trattamenti biologici (e.g. di tipo aerobico o anaerobico).
- Valutazione e gestione del rischio.
- Valutazione delle misure di contenimento fisico; in funzione dei livelli di contenimento - da livello 1 a livello 4 - dei locali da cui provengono i rifiuti sono stabilite le misure di contenimento necessarie alle operazioni di trattamento.
- Verifica e convalida dei procedimenti di trattamento: l'efficienza dei vari processi richiede una convalida secondo metodiche a loro volta convalidate.
Dati gli argomenti trattati, la norma tecnica è ricca di definizioni, tabelle sinottiche, allegati esemplificativi e riferimenti bibliografici.

C. RACCOMANDAZIONI IN MATERIA DI SICUREZZA

Le norme tecniche del CEN - così come le legislazioni nazionali e comunitarie a cui esse si riferiscono - fanno sistematicamente appello all'esigenza di valutare e prevenire i possibili rischi derivanti dall'impiego di agenti biologici, in particolare di quelli collegabili all'impiego delle tecniche dell'ingegneria genetica. Tuttavia, l'utilizzatore di tali agenti biologici troverà in queste norme tecniche delle generiche "linee-guida" piuttosto che rigide "istruzioni" in materia di sicurezza. Anche raccogliendo per molti anni il knowhow dei maggiori esperti d'Europa - come ha fatto il CEN-TC 233 "Biotechnology" - appare evidente come i dati sperimentali non siano ancora sufficienti per la definizione di specifici parametri di sicurezza progettuale delle strutture e degli impianti ed alla identificazione di precise procedure operative.
Anche con queste limitazioni, gli operatori delle produzioni biotecnologiche troveranno nelle norme tecniche del CEN numerosi e validi consigli, atti a migliorare la loro cultura professionale ed a soddisfare in modo armonizzato molte delle esigenze imposte dalle Leggi (i.e. Decreti Legislativi 91/93, 92/93 e 626/94). Appare opportuno ricordare, infatti, che l'impiego di agenti biologici richiede una preventiva e permanente valutazione dei rischi da parte dell'utente e/o del datore di lavoro e suoi collaboratori e che - in caso di incidenti - un giudizio di "imperizia" in sede penale è sufficiente a determinare una sentenza di condanna degli imputati, anche in riconosciuta assenza di loro colpa o dolo (1).
L'impiego di tecnologie biologiche penetra progressivamente nella innovazione delle produzioni agricole ed industriali: di conseguenza, lo state-of-the-art si aggiorna continuamente e certe procedure diventano rapidamente obsolete. Le norme tecniche del CEN costituiscono quindi un punto di partenza, datato alla fine del XX secolo: sarà compito dei biotecnologi del XXI secolo sviluppare ulteriormente le basi conoscitive e le tecniche sperimentali atte ad assicurare un progresso applicativo delle moderne tecnologie biologiche, in cui rischi e benefici siano accuratamente vagliati e costituiscano elementi di rispetto e non di sospetto sociale.
Le biotecnologie non sono un prodotto e, come tali, non costituiscono uno specifico settore di mercato. Esse possono essere utilizzate in un grande numero di produzioni industriali (e.g. dai farmaci ai detergenti) ed agro-alimentari (e.g. dalle materie prime ai cibi): ciascuno di questi settori merceologici ha sviluppato da tempo le proprie norme tecniche, gli adeguati codici di buona pratica e le specificazioni di prodotto. Di conseguenza, appare necessario evitare che queste nuove "norme tecniche in biotecnologia del CEN" costituiscano occasione di discriminazione tra produttori e di turbativa del mercato nei singoli settori merceologici. Le raccomandazioni addizionali in materia di sicurezza delle tecnologie biologiche, canalizzate da queste norme tecniche, devono essere correttamente interpretate come contributo conoscitivo a favore di quanti intendano utilizzare agenti biologici a fini produttivi: qualora pertinenti, esse dovranno essere incorporate nelle specifiche norme tecniche di settore e/o di prodotto.

(1) Questa è una norma giuridica di portata generale, pertinente a tutte le legislazioni collegate ad attività pericolose: tali sono oggi considerate le applicazioni di agenti biologici - in particolare di quelli geneticamente modificati - nella Ricerca & Sviluppo e nelle produzioni agricole ed industriali.