A partire dalla prima Consultazione di esperti della Fao/Oms tenutasi nel 1996 (Fao/Oms 1996) si sono accumulate molte esperienze riguardanti la valutazione della sicurezza dei cibi modificati geneticamente (GM). Il confronto tra le caratteristiche agronomiche e di composizione di questi cibi con gli equivalenti convenzionali è stato riconosciuto come un approccio pratico per affrontare i temi inerenti alla sicurezza riguardanti i prodotti derivati dalle moderne biotecnologie (concetto di equivalenza sostanziale, messo a punto dalla OECD 1993). Occorre sottolineare che l’approccio comparativo con costituisce di per sé una valutazione di sicurezza, bensì è parte di una strategia volta a stabilire se il nuovo prodotto sia altrettanto sicuro di quello ottenuto con metodi tradizionali, che abbia una storia accettabile di uso sicuro. La determinazione dell’equivalenza sostanziale identifica possibili differenze intenzionali e no tra i prodotti GM e quelli convenzionali ed è destinata ad orientare ulteriori studi di valutazione della sicurezza. La strategia generalmente accettata per la valutazione dei cibi GM è
1) quella di ottenere e valutare informazioni sulle caratteristiche di modificazione genetica, ivi incluse le proprietà e le funzioni di geni inseriti artificialmente;
2) di valutare la sicurezza e le proprietà nutrizionali delle nuove sostanze espresse nei cibi;
3) di identificare e valutare cambiamenti inattesi nella composizione del prodotto modificato a causa dell’inserimento di nuovi geni o della soppressione di geni costituenti;
4) di valutare l’influsso della lavorazione di cibi sulle proprietà tossicologiche dei nuovi cibi; 5) e di valutare le modalità di consumo alimentare del prodotto modificato rispetto al prodotto equivalente.

Fondamentali limitazioni nella determinazione dell’equivalenza sostanziale sono:
1) il grado di disponibilità di un opportuno prodotto simile di natura convenzionale con un‘ampia storia di uso sicuro;
2) il grado di disponibilità di dati sulle proprietà agronomiche e di composizione dei prodotti;
3) carenza d’informazione sulle variazioni naturali a livello dei parametri chimici e fisiologici della pianta determinati da variazioni genetiche e fenotipiche;
4) il grado di disponibilità di metodi analitici specifici.

Una delle preoccupazioni riguardanti la sicurezza circa i cibi GM è costituita da una possibile espressione alterata di sostanze tossiche endogene e di antinutrienti oppure dalla formazione di nuove tossine ivi compresi gli allergeni. Occorre sottolineare che i moderni metodi ancora legati a quelli convenzionali e quelli del tutto nuovi di riproduzione possiedono la capacità di indurre tali effetti attraverso riarrangiamenti genomici o con l’inserimento casuale di DNA estraneo a livello di regioni codificanti o regolatrici.

Allo scopo di identificare effetti non intenzionali dovuti a modificazione genetica, l’analisi di singoli composti nei cibi GM è solitamente svolta e confrontata con i dati ottenuti dagli equivalenti tradizionali. Vengono sottoposte a valutazione sia le sostanze nutritive fondamentali sia le sostanze tossiche specifiche della pianta e, inoltre, anche altri costituenti specifici della pianta a seconda della natura della modificazione genetica e di eventuali interferenze con le vie metaboliche.

Inoltre studi sull’alimentazione degli animali con cibi GM possono essere condotti nel caso che si manifestino effetti non intenzionali, o in casi in cui non si disponga di una sufficiente documentazione sulla loro storia. L’informazione disponibile sui cibi GM, introdotti ora sul mercato, i quali contengono in molti casi uno o più geni estranei, indica che questi prodotti non differiscono dai loro analoghi tradizionali, fatta eccezione per i caratteri inseriti, e possono essere considerati altrettanto sicuri dei corrispondenti tradizionali (Kuiper et al., 1999 LANCET).

Tuttavia gli ultimi sviluppi riguardanti la riproduzione delle piante mostrano una crescente diversità di geni utilizzati per modificare le colture e modificazioni con geni multipli che consentono di introdurre nuove vie metaboliche. Ciò renderà la valutazione dell’equivalenza sostanziale più complessa e l’analisi di un singolo composto potrà rivelare effetti secondari potenziali solo per caso, oppure se già noti in anticipo; perciò è desiderabile mettere a punto nuovi metodi che permettano lo screening simultaneo di molti componenti senza previa identificazione.

Questo lavoro descrive e valuta nuovi metodi per studiare alterazioni a carico dell’espressione genica, utilizzando tecniche di tipizzazione fondate sull’uso di mRNA, per studiare l’espressione proteica, utilizzando tecniche di tipizzazione basate sull’impiego di 2D-gelettroforesi/MS e metodi per studiare possibili cambiamenti nelle caratteristiche di metaboliti primari e secondari della pianta, utilizzando tecniche chimiche di fingerprinting. Risulterà che i metodi di tipizzazione richiederanno ulteriori sviluppi e validazioni, prima di potere essere utilizzati correntemente per lo screening di effetti non intenzionali nelle piante transgeniche

Analisi del DNA
Poiché l’alterazione genetica ha luogo a livello del DNA, in teoria la caratterizzazione del sito o dei siti d’inserzione costituisce il più diretto approccio per identificare la comparsa di effetti collaterali non intenzionali di una modificazione genetica. L’analisi della sequenza del sito di inserzione può fornire informazioni riguardanti i geni che vengono interrotti o altrimenti influenzati dalla sequenza inserita. In teoria ciò e vero, ma in pratica le nostre conoscenze sul DNA delle piante in generale e ancor più della maggior parte delle piante coltivate è tuttora alquanto limitata. E benché i programmi di mappatura in corso producano una rilevante quantità di dati sulle fasi di lettura aperte, la conoscenza delle caratteristiche funzionali di queste sequenze è ancora limitata. Anche se si arrivasse a dimostrare che la sequenza introdotta non ha interrotto una sequenza genica, non si può stabilire con certezza se l’inserzione non abbia alterato un gruppo funzionale, ad esempio agendo su fattori di regolazione che possono essere situati a grandi distanze dal gene coinvolto. L’informazione sul DNA genomico delle piante sta crescendo con grande rapidità come ad esempio il progetto di mappatura della Arabidopsis (una ricerca congiunta di diversi gruppi europei, giapponesi e statunitensi , Lin et al.,1999,EU/USA Consortium,1999). L’Arabidopsis è stata scelta come pianta modello per via del suo genoma di piccole dimensioni (440 milioni di paia di basi), e della sua abbondanza in tutto il mondo. Si può già anticipare che, entro certi limiti, l’informazione genetica di Arabidopsis possa essere usata per chiarire analoghe vie metaboliche in altre specie di piante. Perciò il sequenziamento di siti di inserzione o di inserzioni è destinato a veicolare una crescente quantità di informazione e se ne dovrebbe perciò tenere conto. Nel prossimo futuro l’inserzione sito-diretta, mediante l’impiego di sequenze omologhe, d’altro canto, ridurrà il rischio di effetti collaterali indesiderati della modificazione genetica in conseguenza dell’evento inserzionale.

Il più importante inconveniente dell’approccio genomico è che esso non può includere possibili effetti secondari della sequenza genica introdotta e del suo prodotto di espressione. Per superare tale inconveniente sono stati già messi a punto numerosi metodi avanzati per lo screening di alterazioni ai successivi livelli transcrizionali e traduzionali.

Metodi per lo screening di alterazioni dell’mRNA di insiemi trascritti diretti di cellule specifiche o tipi di tessuti, utilizzano gli stessi vantaggi sfruttati nei metodi basati sul DNA: la struttura uniforme dell’mRNA, a scopi pratici, di solito trascritto in cDNA più stabile, la possibilità di riconoscere sequenze simili mediante ibridazioni e di amplificare i frammenti desiderati mediante la reazione a catena della polimerasi (PCR). I metodi per l’individuazione dell’espressione genica alterata può perciò costituire un metodo altrettanto solido di quelli per l’analisi di popolazioni di DNA.

I primi metodi per l’analisi di popolazioni di mRNA erano: il "metodo di visualizzazione differenziale" (Liang e Pardee, 1992) e gli analoghi metodi di AP-PCR ( con innesco arbitrario PCR) (Welsh et al.,1992). Entrambi i metodi possono essere utilizzati per lo screening di espressione genica alterata in varietà transgeniche rispetto alle loro controparti non transgeniche, ma numerosi fattori ne limitano l'impiego ai fini delle normali procedure di screening. Prima di tutto, la riproducibilità dei metodi è limitata in quanto l’annealing (riassociazione) dei primer (inneschi) al cDNA si realizza a temperature alquanto basse, con conseguente riduzione della specificità e differenti configurazioni del bandeggio negli esperimenti successivi. Anche singole bande possono spesso rappresentare più di un frammento di cDNA, rendendo necessaria l’esecuzione di ulteriori esperimenti per l’identificazione di bande relative rispetto alla modificazione genetica. Siccome queste costituivano le prime tecniche di tipizzazione per le popolazioni di mDNA, esse si sono rivelate molto utili in varie situazioni nelle quali piccole alterazioni a carico della trascrizione dell’mRNA venivano anticipate, ad esempio, in successive fasi di sviluppo oppure in condizioni esterne (ad esempio, stress) leggermente alterate. Un altro metodo per l’analisi dell’espressione genica è stato pubblicato nel 1995: "SAGE, analisi in serie dell'espressione genica" (Velculescu et al., 1995). Questo metodo si è rivelato utile anche in situazioni specifiche, ma in generale le procedure sono alquanto laboriose e il metodo non è molto sensibile.

Presso il RIKILT è stato avviato un progetto nel 1994 nel quadro di un programma di Dimostrazione Nazionale, per lo screening dell’espressione genica alterata in varietà di piante modificate geneticamente rispetto alla linea parentale non modificata oppure ad altre piante geneticamente molto simili (Kok et al., 1998). Tra gli obiettivi di questo progetto c’era quello di sviluppare metodi alternativi per l'esecuzione di test per l’identificazione di effetti collaterali non intenzionali in piante coltivate modificate geneticamente. Furono condotte delle ricerche per vedere se l’approccio di visualizzazione differenziale potesse essere usato come metodo standard di screening al fine di identificare l’espressione genica alterata in tessuti specifici di colture alimentari come conseguenza di una modificazione genetica. Come coltura modello fu utilizzato il pomodoro, essendo prodotto alimentare molto importante dal punto di vista economico, nonché per la sua struttura genomica relativamente ordinata e la disponibilità di linee isogeniche di pomodoro. E’ stato dimostrato che il metodo di visualizzazione differenziale può essere impiegato in modo riproducibile e che le forme di bandeggio di pomodori di diverse varietà sono riproducibili e mostrano un elevato grado di omologia e che inoltre possono essere facilmente differenziate, ad esempio, dallo stadio verde delle stesse linee. Inoltre è stato dimostrato che l’espressione del carattere introdotto artificialmente può essere monitorato con l’applicazione del metodo di visualizzazione differenziale. Tuttavia, oltre agli svantaggi del metodo sopra menzionato, si giunse alla conclusione che il metodo era abbastanza impegnativo e richiedeva una notevole abilità individuale. Perciò il metodo non soddisfece le esigenze analitiche perfezionate per l’identificazione di effetti collaterali indesiderati di una modificazione genetica.

La tecnologia del DNA micro-array per gli studi di espressione genica è costituita generalmente da molecole di cDNA che vengono depositate fisicamente su piccole superfici di vetro. Il principale vantaggio della tecnologia del DNA micro-array , rispetto alle tecniche convenzionali di profilo genico, è che essa permette l’analisi su piccola scala di un gran numero di geni nello stesso tempo in maniera sensibile e quantitativa (Schena et al., 1995-1996). Inoltre essa permette di istituire un confronto di tipizzzazione genica in molte diverse condizioni. La tecnologia del cDNA microarray è stata già introdotta con successo in numerose discipline che vanno dalla biologia cellulare e dello sviluppo alla messa a punto di farmaci e alla farmacogenomica. Qui di seguito verrà discusso il suo valore potenziale per la valutazione della sicurezza della modificazione genetica di piante per uso alimentare. Presso il RIKILT è partito un progetto che utilizza la tecnologia del microarray in combinazione con le genoteche informazionali di cDNA, al fine di indagare il potenziale della tecnologia per la valutazione della sicurezza della modifica genetica in piante alimentari. Lo studio dell’espressione genica mediante la tecnologia del microarray è basata sull’ibridazione di mRNA con un array ad alta densità di sequenze bersaglio immobilizzate, ciascuna delle quali corrisponde ad un gene specifico. Degli mRNA provenienti da campioni da analizzare vengono marcati mediante incorporazione di un colorante fluorescente e successivamente ibridizzati con l’array.

La fluorescenza in corrispondenza di ciascun punto sull’array costituisce una misura quantitativa corrispondente al livello di espressione del gene particolare. La tecnologia e il relativo campo di bioinformatica sono ancora in sviluppo e si prevedono ulteriori miglioramenti (Van Hal et al., 2000). Ancora una volta fu scelto il pomodoro come coltura modello. Due genoteche di cDNA informazionali furono ottenute per sottrazione, la prima delle quali costituita da cDNA che sono specifici dello stadio rosso, di maturazione. E l’altro costituito da cDNA verde specifici. L’idea sottesa è che nello stadio verde di maturazione le vie metaboliche che conducono a fattori antinutrizionali, comprese le tossine naturali (ad es., glicoalcaloidi: tomatina e solanina) sono attive, mentre nei pomodori rossi e maturi le vie metaboliche che portano alla formazione di fattori nutrizionali, ad esempio vitamine, saranno molto importanti. Entrambe le genoteche di cDNA vengono localizzate sull’array e oltre a ciò sono state localizzate delle molecole di cDNA selezionate, isolate dal pomodoro sulla base della loro sequenza (resa nota in letteratura), le quali, stando alle previsioni, sarebbero state attive sia in fase rossa che in fase verde, oppure espresse costitutivamente. In questo modo è stato messo a punto un array molto ricco di informazione che potrà ulteriormente essere esteso. L’array è successivamente ibridizzato con degli mRNA che vengono isolati da diverse varietà in studio, sia modificate geneticamente che non. I primi esperimenti di ibridazione mostrano che le sottrazioni di cDNA sulla base di genoteche informazionali si sono rivelate molto produttive e che le configurazioni di fluorescenza ottenute sono largamente riproducibili (risultati non pubblicati). In questo momento il metodo è sottoposto a ulteriori approfondimenti e la prospettiva che emerge è che questo metodo possa essere usato efficacemente per lo screening dell’espressione genica alterata e fornire allo stesso tempo dati iniziali sulla natura di alterazioni rivelate, per vedere se le alterazioni osservate possono influire sulla sicurezza o sul valore nutrizionale delle colture in esame.

Proteomica

Gli studi del genoma vegetale forniscono notevoli informazioni sul potenziale della sintesi proteica ma non sulla espressione effettiva. La correlazione tra l’espressione dell’mRNA e dei livelli proteici è generalmente scarsa, in quantoquella velocità di degradazione dei singoli mRNA e quella delle proteine sono diverse. Inoltre la glicosilazione e la fosforilazione di un prodotto genico inserito potrebbe dar luogo ad un’attività e stabilità proteica alterata. La comprensione delle complessità biologiche nella cellula vegetale deve essere approfondita ulteriormente e può essere estesa mediante l’impiego della proteomica, una tecnica che analizza molte proteine simultaneamente (Abbott, 1999). Attualmente la metodica più appropriata per gli studi di espressione proteica è costituita dalla gel-elettroforesi-2D, seguita da escissione delle chiazze proteiche del gel, digestione in frammenti ad opera di proteasi specifiche e successiva analisi con spettrometria di massa, peptide mass fingerprinting. Esso permette l’identificazione di proteine mediante confronto della massa di frammenti peptidici con i dati previsti a livello d’informazione genetica o di sequenza proteica. Altre tecnologie molto più veloci, come ad esempio gli approcci basati su chip proteici, sono in corso di sviluppo.

La tecnologia proteomica è già stata introdotta con successo nelle discipline mediche, come ad es. in oncologia (J.E. Celis, 1998), ma molti ostacoli tecnici si frappongono al raggiungimento dell’obiettivo. Ad esempio, a differenza del DNA, le proteine possono cambiare di continuo la loro struttura secondaria, terziaria e quaternaria, a seconda del trasferimento e dell’espressione in diversi tessuti e compartimenti cellulari, influenzando di conseguenza il comportamento elettroforetico e la massa molecolare. La proteomica, nonché le tecniche di tipizzazione dell’mRNA, si fondano sui database genomici per facilitare l’identificazione e la caratterizzazione della funzione (C. Burks, 1999).

L’introduzione di nuovi geni (di origine batterica) in piante può indurre modificazioni post-traduzionali di proteine (ad esempio, glicosilazione), che possono provocare alterazioni a carico dell’attività e della stabilità delle medesime, modificandone altresì, in taluni casi, le caratteristiche allergeniche. Si possono inoltre verificare dei cambiamenti del tipo di configurazione della glicosilazione a seguito dell’inattivazione della glicosidasi e della glicosiltransferasi nella cellula ospite (Jenkins et al.,1994). E’ stata messa a punto una tecnica per l’isolamento, la purificazione e la caratterizzazione di oligosaccaridi in tessuti vegetali, prendendo pomodori transgenici Bt, facendo esprimere il gene cryIA5, come modello (Zeleny et al., 1999, Noteborn et al., 1995). Le glicoproteine isolate sono state separate e studiate a livello strutturale mediante ripetute HPLC 2D (cromatografia liquida ad alte prestazioni). Per un ulteriore conferma strutturale è stata applicata la MALDI-TOF. Il profilo dei carboidrati dei frutti verdi e d quelli rossi e maturi di piante di pomodoro modificate con Bt e non modificate non ha evidenziato alcuna differenza per quanto riguarda la natura degli N-glicani, né sono state riscontrate particolari differenze quanto al contenuto di glicani. Da notare che le quantità relative evidenziate erano abbastanza simili al variare delle stagioni e confrontabili con una varietà commerciale utilizzata come controllo esteso.

Tipizzazione del metaboloma (fingerprinting chimico)

Un’analisi multicomposizionale di composti biologicamente attivi nelle piante, vale a dire nutrienti, fattori antinutrizionali, sostanze tossiche ed altri composti analoghi (il cosiddetto metaboloma) può indicare se hanno avuto luogo effetti voluti e/o non voluti come risultato della modificazione genetica. Questo approccio permette di superare i limiti propri dell’analisi di composti single known (singoli) per i quali sono disponibili metodi di rivelazione. Un’alternativa interessante è l’impiego della NMR protonica ad alta risoluzione in combinazione con la cromatografia liquida (Foxall et al., 1996, Korham-mer e Bernreut-her , 1996, Lindon e Nicholson, 1997). Di recente è stato dimostrato che l’impiego di tecniche di fingerprinting chimico, mediante LC-NMR off-line, può fornire informazioni su possibili cambiamenti in matrici vegetali a causa di variazioni delle condizioni ambientali (Lommen et al., 1999).

La determinazione del fingerprint chimico era basato sulla rivelazione di alterazioni degli spettri 1H-NMR ottenuti da diversi estratti con acqua o solventi organici a partire da varietà di pomodoro modificate geneticamente, come ad esempio il frutto contenente l’RNA antisenso per l’esogalattanasi, e da quelle corrispondenti non modificate (Noteborn et al., 1998-2000). Si possono ottenere le differenze di concentrazione di componenti a basso peso molecolare (PM< 10 kDa) mediante sottrazione degli spettri 1H-NMR.

Per potere discriminare tra differenze che possono sorgere da modificazioni genetiche oppure da influenze ambientali occorre procedere all’esecuzione di analisi statistiche che tengono conto di variazioni, tipo quelle dello stadio di coltivazione, localizzazione, logistiche o clima (Sacs, 1984).

I fingerprint degli OMG dovrebbero in primo luogo essere confrontati con quelli (1) appartenenti a linee di controllo isogeniche fatte crescere una accanto all’altra in un solo appezzamento di terreno e in siti diversi, e (2) con una vasta gamma di varietà commerciali di quella data pianta da raccolto, al fine di interpretare l’importanza biologica di eventuali caratteristiche significative che contradistinguono gli OMG rispetto alla linea parentale.

Il RIKILT e dieci laboratori europei stanno sottoponendo a test diversi metodi da impiegare per la rivelazione e la caratterizzazione di effetti non voluti conseguenti a modificazioni genetiche. Nel contesto di questo progetto dell’UE, denominato GMOCARE (QLK1-1999-00765), vengono messi in atto i suddetti approcci, comprendenti la genomica funzionale (con l’impiego dei microarrey di DNA), la proteomica (mediante l’uso della PAGE-MS 2D) e la tipizzazione dei metaboliti. Verranno analizzate variazioni nella composizione di piante MG nonché di piante di controllo che non contengono il gene bersaglio ma che sono passate attraverso la procedura di trasformazione. Le piante MG utilizzate comprendono i pomodori con elevato contenuto di carotenoidi e patate con modificazioni del contenuto di amido, poliamine, glicoalcaloidi e amminoacidi. Altre linee MG come Arabidopsis e Nicotiana verranno utilizzate per determinare quali geni sono coinvolti nel metabolismo dei flavonoidi e della lisina, nella crescita e nello sviluppo. Questo tipo di informazione può fornire, a seconda delle esigenze, opportuni biomarker da utilizzare per l’identificazione di effetti non intenzionali dovuti a modificazione genetica.

1. I primi metodi di mRNA fingerprinting sono di difficile attuazione ai fini dello screening abituale. I metodi sono laboriosi e la loro riproducibilità è limitata. Inoltre le differenze che emergono a livello di configurazione delle bande non possono essere poste direttamente in relazione con la sottostante espressione di geni, conseguendone una drastica riduzione dell’efficacia dei metodi. Il metodo della sottrazione di cDNA in combinazione con la tecnologia del microarray potrà essere impiegato con profitto nello screening dell’espressione genica alterata dovuta a modificazione genetica. Questo metodo può altresì fornire utili informazioni sulla natura di alterazioni identificate, cioè se esse possano realmente esercitare un qualche effetto sulla sicurezza o sulle proprietà nutrizionali delle colture oggetto di studio.

2. La proteomica è un potente strumento potenziale per lo studio delle differenze nell’espressione proteica in piante transgeniche. La crescente diversità di geni e geni multipli impiegati per modificare i raccolti e le conseguenti accresciute possibilità di alterare le vie metaboliche o di introduzione di nuove sottolinea la necessità di applicare questa tecnica per l’identificazione di effetti non intenzionali (deliberati) in piante transgeniche.

3. Il fingerprinting chimico è promettente rispetto all’analisi comunemente praticata, e queste tecniche dovrebbero essere ulteriormente sviluppate congiuntamente con altri metodi analitici (LC-NMR-MS). La specificità e la sensibilità del metodo sono accettabili.

4. Le tecniche di tipizzazione possono contribuire all’identificazione e alla caratterizzazione di effetti non intenzionali in piante transgeniche. Tuttavia devono essere affrontati numerosi problemi prima che questi metodi possano trovare impiego nelle normali procedure: (1) standardizzazione della raccolta e della preparazione dei campioni nonché delle procedure di estrazione, (2) standardizzazione e validazione delle misurazioni, (3) dati limitati sui profili e le variazioni naturali, e (4) mancanza di sistemi bioinformatici per il trattamento di grandi quantità di dati.