I composti fenolici appartengono alla famiglia delle sostanze aromatiche, i costituenti organici più diffusi nella biosfera dopo i carboidrati In natura una delle fonti più importanti di composti fenolici è la lignina polimero poco degradabile costituito da unità di fenilpropanolo. Fonti di sostanze fenoliche naturali più facilmente degradabili sono invece gli acidi fenolici e gli aminoacidi aromatici (1).
Con lo sviluppo industriale, è stata introdotta nell'ambiente una grande varietà di nuovi composti fenolici derivati da processi di lavorazione e trattamento di sostanze più complesse o utilizzati per le loro proprietà di pesticidi, erbicidi e fungicidi (clorofenoli, dinitrofenoli), detergenti (alchilfenoli, nonilfenoli), conservanti e sbiancanti (nitrofenoli, clorofenoli).
La maggior parte di questi composti è da annoverarsi tra gli xenobiotici, cioè prodotti non presenti normalmente in natura.
Dalla massiccia immissione di tali sostanze nell'ambiente è derivato un diffuso inquinamento (1). La presenza e la stabilità dell'anello benzenico rendono infatti difficile la degradazione di molte sostanze fenoliche, determinando il loro accumulo negli ambienti naturali.

La recalcitranza alla degradazione di questi composti, che aumenta in funzione del numero e della natura dei residui presenti sull'anello, ha destato preoccupazione a causa della tossicità di molti di essi.
Bisogna inoltre tener presente che alcuni dei loro prodotti intermedi di degradazione possono essere ancora più tossici del composto iniziale e che possono andare incontro a fenomeni di "bioamplificazione", ovvero all'accumulo da parte di alcuni organismi e al conseguente inserimento nella catena alimentare.
I problemi posti dalla persistenza ambientale dei composti fenolici sono stati in alcuni casi affrontati tramite tecniche di biorisanamento (bioremediation), metodi cioè che utilizzano microrganismi per eliminare inquinanti da siti contaminati (2-5).

Modalità di Biodegrndazione
Nonostante in alcuni casi, come per i clorofenoli, sia possibile una degradazione abiotica attraverso idrolisi o fotolisi (6), è noto che la biodegradazione degli inquinanti, incompleta o completa (mineralizzazione), avviene principalmente ad opera di microrganismi.
Le reazioni di degradazione possono avvenire in condizioni aerobie o anaerobie (1). Nel primo caso, i microrganismi utilizzano in genere una via metabolica comune che coinvolge le ossigenasi.
Questi enzimi preparano i substrati per la scissione dell'anello benzenico aggiungendo sostituenti idrossilici al nucleo aromatico, che viene poi scisso in composti più assimilabili.
Negli ambienti aerobi, l'ossigeno è l'accettore terminale di elettroni ed è spesso anche un agente indispensabile per le reazioni iniziali di degradazione.
In anaerobiosi possono essere utilizzati come accettori alternativi di elettroni il nitrato, il solfato o il carbonato e il passaggio centrale per la biodegradazione degli inquinanti aromatici sembra essere la via riducente del benzoato.

Le strategie di biorisanamento
Le tecniche di biorisanamento sono state sperimentate per la prima volta nell'industria petrolchimica negli anni '70 ed oggi sono divenute una alternativa comune alla decontaminazione chimica o fisica, grazie al loro basso costo e minimo impatto ambientale.
Le strategie adoperate per il risanamento di siti contaminati si possono ricondurre essenzialmente a due tipologie (7):
- stimolazione della microflora degradativa endogena tramite l'aggiunta di substrati (biostimolazione)

- aggiunte (cicliche o meno) al sito contaminato di batteri degradatori selezionati in laboratorio e possibilmente derivati dall'ambiente stesso (bioaugmentation).

In alcuni casi questi microrganismi possono essere stati modificati geneticamente per migliorarne le capacità degradative.
Perché la bioaugmentation abbia successo gli organismi inoculati devono riuscire a sopravvivere e a competere con le comunità naturali mantenendo buoni livelli di attività degradativa. Non sempre questo succede ed è la ragione per cui questo metodo è da molti considerato inaffidabile.

Ciò nonostante, è ancora oggetto di notevole interesse e potrebbe essere l'unico mezzo per un efficace biorisanamento in situazioni in cui i degradatori endogeni non riescano ad attaccare rapidamente gli inquinanti (7, 8).
Poiché le attuali conoscenze sulla diversità dei microrganismi, sui loro rapporti e sui fattori ambientali che la/li influenzano sono scarse, il loro miglioramento può essere molto importante per una maggiore efficacia delle strategie di bioremediation.

Sia per la rilevazione ambientale degli inquinanti che per la conoscenza della biodiversità microbica e per seguire sviluppo e attività dei microrganismi aggiunti, è stato ed è determinante lo sviluppo di metologie molecolari che consentono di studiare i microrganismi sia ex situ che in situ. E' infatti evidente che il monitoraggio è parte integrante della bioremediation e spesso la specificità, sensibilità e affidabilità delle tecniche usate influenzano la scelta delle strategie di decontaminazione da utilizzare.
Le tecniche analitiche normalmente utilizzate per misurare l’attività microbica e i livelli di inquinanti, come la respirometria, la cromatografia, la spettroscopia e l'HPLC (cromatografia in fase liquida ad alta pressione), sono spesso di utilità limitata nella rilevazione di basse concentrazioni dei substrati di interesse.
Biosensori, sonde geniche, tecniche di PCR e saggi immunologici, metodi veloci e ad elevata risoluzione, sono invece in grado di rilevare concentrazioni molto basse del bersaglio.
Ad esempio, biosensori microbici che utilizzano fusioni tra geni che codificano prodotti (i citocromi P450, P420 e ossidasi a funzione mista) coinvolti nella degradazione dei bifenili policlorurati (PCB) e geni reporter come quelli che conferiscono bioluminescenza si sono dimostrati biomarcatori affidabili per la rilevazione di livelli di esposizione ai PCB nei fegati di foche che vivono vicine ai porti (5). Nessuno dei metodi nominati precedentemente è comunque in grado di rilevare inequivocabilmente le attività proprie delle singole cellule microbiche e per tale scopo sarà molto importante lo sviluppo delle sonde per RNA messaggero (mRNA).

Approcci alla bioaugmentation
Vi sono alcune caratteristiche che i microrganismi usati per la bioaugmentation dovrebbero possedere, come la azione rapida, la vita breve se manipolati geneticamente o provenienti da ambienti differenti da quello inquinato (per evitare possibili danni a lungo termine), la capacità di penetrare nelle zone di accumulo dell'inquinante e di entrare bene in contatto con esso, la resilienza (resistenza a fluttuazioni di pH, forza ionica, alte concentrazioni di metalli ecc.), ed eventualmente attività degradativa verso più tipi di xenobiotici (8).
Per tali ragioni, maggiori possibilità di successo possono essere offerte se i microrganismi sono stati selezionati dallo stesso ambiente da inoculare. Queste ragioni sono probabilmente alla base dello scarso numero di esperimenti in campo e ai loro esiti spesso contrastanti. Inoltre l'applicazione in campo deve essere necessariamente preceduta da una lunga serie di esperimenti che vanno dalla selezione/isolamento della microflora a verifiche di laboratorio tese a stabilire il comportamento e l'efficacia degradativa del microrganismo o dei consorzi da reinoculare. E' importante che le condizioni in cui tali esperimenti vengono effettuati siano più simili possibile a quelle del sito contaminato e a tale scopo è fondamentale che la fase immediatamente precedente l'applicazione in campo preveda l'uso di micro- e mesocosmi. Inoltre, dato che la degradazione di xenobiotici è difficilmente attuata da un unico microrganismo, la selezione di consorzi naturali o artificiali può essere vantaggiosa.

Problemi legati alla bioaugmentation e possibili soluzioni
Le principali difficoltà che i microrganismi possono incontrare durante i processi di biodegradazione (1, 8) sono:
· La scarsa biodisponibilità di alcuni composti a causa della loro struttura; ad esempio, la lignina è un polimero di grandi dimensioni impossibile da idrolizzare per la maggior parte dei microrganismi. Solo alcuni attinomiceti e dei funghi parassiti bianchi che producono enzimi extracellulari ligninolitici sono in grado di attaccare la lignina, rilasciando frammenti più corti che possono poi essere degradati da batteri non ligninolitici aerobi e anacrobi. Una elevata apolarità e la tendenza ad assorbirsi alla materia organica del suolo e alle matrici dei sedimenti sono caratteristiche che possono diminuire fortemente la biodisponibilità di molti composti aromatici.
· I limiti degradativi intrinseci dei microrganismi rispetto al substrato e alle condizioni ambientali. Ad esempio, in condizioni aerobici molecole con elettroaccettori (gruppi cloro, nitro e azo) sono resistenti alla degradazione perché impediscono l'attacco elettrofilo dell'anello aromatico da parte dell'ossigeno. L'opposto succede in anaerobiosi, cioè la presenza di gruppi elettrodonatori impedisce l'attacco nucleofilo.
· La formazione di dimeri e polimeri conseguenti all'attacco ossidativo dei radicali liberi. Le sostanze ad alto peso molecolare che si formano hanno una elevata stabilità, rimanendo tali per più di 500 anni. Inoltre, piante, funghi ed attinomiceti rilasciano nell'ambiente enzimi ossidanti come le tirosinasi, le laccasi e le perossidasi che possono attaccare le sostanze fenoliche, rendendole maggiormente suscettibili alla polimerizzazione.
· La riduzione dell'attività microbica dovuta alle condizioni ambientali (temperatura, umidità, forza ionica) e a limitazione della diffusione del composto.
· Parametri di nicchia che possono influenzare le capacità degradative dei microrganismi indigeni o aggiunti: fitness (competizione, sinergia...), predatori, concentrazione microbica in fase stazionaria di crescita.
Possibili soluzioni a questi problemi sono:
· Il preadattamento dei batteri da inoculare (3, 9).
· L'aggiunta all'ambiente contaminato di nutrienti inorganici e/o organici, di accettori o donatori di elettroni, di ossigeno per stimolare il metabolismo della microflora endogena o inoculata e/o di sostanze che favoriscano l'aumento della biodisponibilità favorendo il contatto tra inquinanti e batteri (3, 5).
· L'alternanza di fasi aerobiche e anaerobiche. Un esempio è dato dalla rimozione di nitrati e fosfati dalle acque reflue, passaggio fondamentale per evitare fenomeni di eutrofizzazione (1).
· Immobilizzazione su matrici e incapsulamento. L'uso di questo tipo di tecnologie sembra essere estremamente promettente sia per quanto riguarda l'efficacia degradativa dei ceppi o consorzi immobilizzati, sia per quanto riguarda la loro vitalità a lungo termine (8, 9).
· Inoculi ripetuti (4, 8).
· Uso di microrganismi che, pur non intervenendo nel processo degradativo, ne favoriscono l'attuazione indirettamente fornendo o sottraendo metaboliti alla microflora degradativa o favorendo un processo fisico. E' quest'ultimo il caso dei metalli pesanti la cui precipitazione è promossa dalla produzione di acido solfidrico effettuata da batteri solfato-riducenti (5).

Bioaugmentation di composti fenolici
Le prove finora effettuate riguardano esperimenti in micro e mesocosmi (Tabella 1). Le ricerche sono state effettuate sia con inoculo di singoli microrganismi che di consorzi microbici naturali o artificiali.
Tre di questi studi riguardano la bioremediation di suoli contaminati rispettivamente da pentaclorofenolo (PCP), uno dei più diffusi antiparassitari (2, 10), e da 2-sec-butil-4,6-dinitrofenolo (dinoseb) sostanza usata come erbicida (11). Per quanto riguarda il PCP entrambi le ricerche pubblicate mettono in evidenza differenze tra diversi suoli inquinati riguardo alla presenza di microflora endogena degradativa. L' interessante notare come l'effetto positivo, ottenuto con l'inoculo di un ceppo di Flavobacterium, possa essere migliorato agendo anche su un parametro importante come il contenuto d'acqua (10). L'efficacia del preadattamento e dell'uso di un consorzio microbico naturale è invece messa in evidenza nella ricerca di Barbeau et al. (2). Risultati contrastanti, che riflettono le differenze negli ambienti di partenza, vengono ottenuti anche nel caso del dinoseb (11). La procedura di bioaugmentation ha infatti successo solo nel caso di uno dei due suoli contaminati. Particolarmente interessante è la recente indagine riguardante la possibilità di operare una bioaugmentation inoculando nel sito contaminato plasmidi catabolici che, una volta acquisiti dai microrganismi, sono in grado di promuovere il potenziale degradativo di comunità che mancano degli organismi o dei geni necessari per una rapida eliminazione dello xenobiotico (12).
I fanghi attivi e in genere le comunità microbiche degli impianti di trattamento dei liquami, siano essi a biomassa dispersa o adesa, rappresentano essi stessi dei sistemi di bioaugmentation, in quanto la degradazione degli inquinanti avviene ad opera di queste stesse comunità che si sviluppano a seguito dell'ingresso dei reflui da trattare (1). Quando gli impianti trattano reflui contenenti inquinanti recalcitranti è comunque possibile che non si riesca a raggiungere un livello di abbattimento soddisfacente in assoluto o relativamente ad alcune fasi del processo. Anche nei migliori impianti di trattamento sono infatti inevitabili le fluttuazioni ambientali. La bioaugmentation con microrganismi selezionati potrebbe essere in questi casi una delle vie per risolvere i problemi legati alla loro efficienza. Il lavoro di Selvaratnam (13), oltre a mettere in luce l'utilità della bioaugmentation con un ceppo di Pseudomonas plitida degradatore di fenolo, puntualizza e dimostra l'utilità di alcune tecniche molecolari per il controllo della sopravvivenza del ceppo stesso. Sembra quindi di poter ribadire che la bioaugmentation potrebbe essere un utile mezzo per il risanamento di ambienti contaminati da composti fenolici, ma che non sempre questo è vero e che la sua efficacia deve essere accuratamente valutata caso per caso.
Nel nostro laboratorio è stato recentemente iniziato uno studio teso a migliorare tramite bioaugmentation la degradazione dei nonilfenoli polietossilati (NPE) effettuata dalla flora microbica di un depuratore a fanghi attivi.
I nonilfenoli polietossilati (NPE) sono tensioattivi non ionici che, malgrado la potenziale tossicità e recalcitranza alla degradazione dei principali intermedi di degradazione, sono ampiamente usati in vari tipi di industrie, tra cui quella tessile, per la loro versatilità ed economicità (14, 15). Depuratori di zone ad alta concentrazione di industrie tessili, come quella di Prato, hanno reflui arricchiti in NPE e in particolare quando vi siano brevi tempi di ritenzione nella vasca di ossidazione, la degradazione di questi tensioattivi può essere problematica. Nel nostro laboratorio abbiamo isolato batteri coinvolti nell'utilizzazione di NPF con catena laterale di 6 (NPL-6) e 9 (NPE-9) etossili, maggiormente usati nell'industria tessile, da fanghi attivi di alcuni depuratori. Una parte degli isolati, caratterizzata mediante metodi fisiologici e/o molecolari, è stata adoperata per ottenere diversi consorzi microbici esaminati poi per la loro attività degradativa nei confronti dei suddetti NPF in terreno minerale e in condizioni di cometabolismo con acetato di sodio allo 0.2%. Le quattro miscele con migliore attività degradativa sono state analizzate, nelle stesse condizioni sperimentali, per la capacità di competere con la microflora dei fanghi attivi del principale depuratore della provincia di Prato. Il consorzio artificiale che ha dimostrato migliori capacità di competizione è stato usato per una prima prova di bioaugmentation in coltura discontinua. A tale scopo, il consorzio è stato inoculato nell'afflucnte dello stesso depuratore (prelevato il giorno stesso) a una concentrazione di 5X10⁸ cellule/ml. L'incubazione è avvenuta per un totale di 72 ore e la degradazione in assenza e presenza di inoculo è stata saggiata a tre diversi tempi di incubazione (5, 24, 72 ore). I risultati ottenuti hanno mostrato che l'inoculo ha provocato un miglioramento del 10% nella efficienza degradativa della flora microbica dell’affluente dopo 5 ore di incubazione. Il miglioramento permane nelle successive rilevazioni anche se molto diminuito (2%). Sebbene siano necessari ulteriori esperimenti, i risultati sembrano essere promettenti per un possibile uso migliorativo di questo od altro consorzio selezionato, eventualmente preadattato, usato non più come biomassa dispersa ma adesa.

AMBIENTE	CONTAMINANTE	CEPPO/CONSORZIO
Suolo	pentaclorofeenolo (PCP)	Flavobacterium ATCC 39723 (10)*
Suolo	pentaclorofeenolo (PCP)	Consorzio (2)*
Suolo	dinoseb	Consorzio (11)
Suolo	Acido 2,4 - dicolorofenossiacetico	E.coli contiene plasmidi catabolici di Ralstonia eutropha (12)*
Fanghi attivi	Fenolo	P.putida ATCC 11172 (13)*
Reflui da autolavaggio	Tensioattivi non ionici carburante	Consorzio (3)*

1. Field JA, Stams AJM, Kato M, Schraa G. Enhanced biodegradation of aromatic pollutants in coculturcs of anacrobic and aerobic bacterial consortia. Antonie Van Leewenhoek. 1995; 67: 47-77.
2. Barbeau C, Deschênes E, Karamanev D, Comeau Y, Samson R. Bioremediation of pentachlorophenol-contaminated soil by bioaugmentation using activated soil. Appl. Microbiol. Biotechnol. 997; 48: 745-52.
3. Margesin R, Schinner F. Low-temperature bioremediation of a waste water contaminated with anionic surfactants and 61,1 soil. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998; 49: 482-6.
4. Newcombe DA, Crowley DE. Bioremediation of atrazine-contaminated soil by repeated applications of atrazine-degrading bacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999; 51: 877-82. 5.
5. Jones WR. Practical applications of marine bioremediation. Curr. Opin. Biotechnol. 1998; 9: 300-4.
6. Hwang HM, Hodsou RE, Lee RF Degradation of phenol and Chlorophenols by sunlight and microbes in estuarine water. Environ. Sci. Technol. 1986; 20:1002-7.
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8. Vogel TM. Bioaugmentation as a soil bioremediation approach. Curr. Opin. Biotechnol. 1996; 7: 311-6.
9. Hajji KT, Lépine F, Bisaillon JG, Beaudet R, Hawari J. Effects of bioaugmentation strategies in UASB reactors with a methanogenic consortium for removal of phenolic compounds. Biotechnol Bioeng. 2000; 67:417-23.
10. Seech AG,Trevors JT, Bulman TL. Biodegradation of pentachlorophenol in soil: the response to physical, chemical, and biological treatments. Can. J. Microbiol. 1991; 37: 440-4.
11. Kaake RH, Roberts DJ, Stevens TO, Crawford RE, Crawford DL. Bioremediation of soils contaminated with the herbicide 2-sec-butyl-4,6-dinitrophenol (dinoseb). Appl. Environ. Microbiol. 1992; 58: 1683-9.
12. Top EM, Van Daele P, De Saeyer N, Forney LJ. Enhancement of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) degradation in soil by dissemination of catabolic plasmid. Antonie Van Leewenhoek. 1998; 73:87-94.
13. Selvaratnam 5, Schoedel BA, McFarland BL, Kulpa CF Application of the polymerase chain reaction (PCR) and reverse transcriptase/PCR for determining the fate of phenol-degrading Pseudnmonas putida ATCC 11172 in a bioaugmented sequencing batch reactor. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997; 47: 236-40.
14. Yoshimura K. Biodegradation and fish toxicity of non ionic surfactants. J. Am. Oil Chem. Soc. 1986; 63:1 590-6.
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